MÉTODOS ANALÍTICOS ELEMENTALES EN ECOLOGÍA MARINA

EQUIPO DE CIENCIAS NATURALES «LOS FILABRES» 

SERIE DIDÁCTICA - PRÁCTICAS

Por 

Valeriano Rodríguez Martínez

Antonio Ramírez Zea

José Luis López González

ALMERÍA -1981

ARTES GRÁFICAS ALMERÍA – Cantares, 4

Depósito Legal: AL-86-1981

EDICIÓN DIGITAL: © ALMEDIAM SEPTIEMBRE DE 2004

INTRODUCCIÓN

Colaborando y continuando con la línea de trabajo emprendida en 1980 por el Equipo de Ciencias Naturales "Los Filabres",y manifestada a través de sus Cuadernos, el trabajo que sigue a continuación no es más que una revisión bibliográfica actualizada de una serie de técnicas analíticas muy estandarizadas, simples recetas, para la cuantificación de algunos parámetros químicos y biológicos fundamentales en el funcionamiento de un ecosistema acuático.

A la hora de su selección, obligatoriamente reducida, hemos intentado conjugar de una parte la máxima importancia del parámetro en cuestión, y de otra, la mayor simplicidad de su determinación. Como resultado de la aplicación de este criterio hemos extraído un número de ellos de siete que cubren bastante bien el espectro de los factores ambientales más comúnmente evaluados en estudios de Ecología Marina y Limnología.

Los objetivos que nos hemos fijado con la realización de este cursillo y la redacción del presente guión de seguimiento no son, en principio, mas que poner al alcance de las personas o grupos interesados unos métodos de trabajo ampliamente utilizados y sencillos aunque quizás de difícil acceso y localización, a pesar de existir ya publicaciones españolas a las que remito en la bibliografía a aquellos que quieran completar o ampliar.

Como consecuencia de esta motivación, un segundo objetivo más lejano pero sin duda más importante, sería el encauzamiento de estas inquietudes hacia la obtención masiva de datos y descripción del funcionamiento de nuestros medios acuáticos que nos permitiría, en una segunda etapa, su predicción.

Almería, mayo 1981

LOS AUTORES.

1. OXIGENO DISUELTO.

1.1. Introducción.

Los niveles de oxígeno disuelto en un medio acuático son el resultado de la actuación simultanea de una serie de factores tanto físico, químicos como bioquímicos que prevalecen en una masa de agua. Este oxígeno se produce en la capa superficial por cambio con la atmósfera por una parte y por las plantas en el curso de la fotosíntesis por otra. Es consumido en toda la columna de agua por la respiración de los organismos aerobios y por los oxidantes. A estas fuentes de variación se superponen los cambios laterales y verticales entre masas de agua de características diferentes. De forma suplementaria, las aguas usadas por la actividad humana son una fuente de perturbaciones del balance de oxígeno.

1.2. Fundamento.

El método a seguir es básicamente el de WlNKLER, que consiste en que al añadir a la muestra una sal manganosa en medio fuertemente alcalino, los iones manganeso precipitan formando hidróxido y siendo rápidamente oxidados en cantidades equivalentes, a hidróxidos de más alto estado de valencia por el oxígeno presente en la muestra.

2 Mn (OH)2+ O2 2 Mn O (OH)2

En presencia de iones I¯ y en medio ácido, este precipitado se disuelve y el manganeso revierte al estado bivalente con la liberación de I2 en solución de I¯ en cantidades equivalentes al oxígeno originalmente presente en la muestra.

Mn O (OH)2+ 4H+ 3I¯ Mn2+3+ 3H2O

El I2 liberado se titula con una solución de tiosulfato.

1.3. Reactivos.

Solución de sulfato manganoso: Disolver 480 gr. de SO4 Mn  4H2O, 400 gr. de SO4 Mn  2H2O ó 364 gr. de SO4 Mn  H2O en 1000 ml. de agua destilada.

Solución alcalina de I¯. Se prepara siguiendo uno de los dos procedimientos siguientes:

A) 500 gr. de KOH ó NaOH en 500 ml. de agua destilada.

B) 300 gr. de IK ó INa en 450 ml. de agua destilada.

Se mezclan con precaución estas 2 soluciones y se renueva cada mes.

- Ácido sulfúrico concentrado.

- Solución de iodato potásico 0.01 N: Pesar 0.3567 gr. de IO3K seco (105 ºC durante 1 h.) en 1000 ml. de agua destilada.

- Indicador coloreado: Solución de almidón al 2%

- Solución de tiosulfato 0.01 N: Disolver 2.9 gr. de Na2S2O3. 5H2O en 1000 ml. de agua recién hervida y guardar en frasco oscuro.

1. 4. Toma de muestras.

Las muestras para oxígeno disuelto han de ser tomadas con mucha precaución, evitando su agitación y el contacto con el aire que causaría cambios en el contenido gaseoso. Se transfiere a una botella de vidrio topacio y tapón esmerilado que se ha de llenar hasta el borde de modo que al introducir el tapón este desborde una cantidad de agua equivalente a su volumen y no quede ninguna burbuja. Inmediatamente se le añade 1 ml. de la solución de sulfato manganoso y después 1 ml. de solución alcalina, se tapa y agita vigorosamente. Se deja reposar por espacio de 3 minutos, al cabo de los cuales se agita de nuevo, acumulándose posteriormente el precipitado en la parte inferior de la botella.

1.5. Preservación y Almacenamiento.

La determinación del oxígeno disuelto debe hacerse inmediatamente en aquellas muestras con apreciable demanda de oxígeno. No obstante, para aquellas en las que esta no es importante, las muestras se pueden conservar por un cierto tiempo al abrigo de la luz y a temperatura ambiente que evite la contracción del líquido ó inmersa en agua.

1.6. Operaciones analíticas.

1.6.1. Muestra problema.

Se añade 1 ml. de sulfúrico a la botella y se agita hasta la disolución del precipitado. A continuación, se extraen de ella 50 ml. con la ayuda de una pipeta y se transfieren a un matraz erlenmeyer y se titula con la solución de tiosulfato hasta que la coloración amarillo fuerte pase a amarillo pajizo, momento en el que se le añade 1 ml. de solución indicadora y se continúa la valoración hasta que la muestra esté incolora.

1.6.2. Determinación del blanco y contrastación de la normalidad del tiosulfato.

Se llena una botella con agua destilada y se le añaden 1 ml. de sulfúrico y 1 ml. de solución alcalina. Se tapa y agita vigorosamente. Se añade 1 ml. de solución de sulfato manganoso, se agita y se toman varias submuestras de 50 ml.

1.6.2.1. Determinación del blanco.

Sobre una submuestra de 50 ml., añadir el almidón y valorar con tiosulfato. El gasto de tiosulfato ha de ser inferior a 0.1 ml. y ha de realizarse siempre que se tengan reactivos nuevos o se sospeche de su estado.

1.6.2.2. Constrastación de la normalidad.

A otra submuestra de 50 ml. se añaden 5 ml. de la solución patrón de iodato potásico 0.01 N. Se deja reaccionar durante 2 minutos y se analiza como una muestra problema. Si V2 es el volumen de tiosulfato gastado, la normalidad de la solución de tiosulfato será:

 

1. 7. Cálculos.

El contenido de oxígeno de la muestra lo obtenemos mediante la expresión:

En el caso, más interesante desde el punto de vista biológico, de poder expresarlo en tanto por ciento de saturación:

2. NUTRIENTES.

Parece que los elementos que tienen mayor probabilidad de quedar en cantidad insuficiente en los medios acuáticos y limitar así la producción de materia viva son, junto con la luz, el Nitrógeno ,el Fósforo y el Silicio. En consecuencia se les llama elementos nutritivos y su concentración en las aguas, esencialmente variable en el espacio y en el tiempo a causa de su papel biológico, va a influir primordialmente sobre los productores primarios, determinando la distribución o la abundancia de unas u otras especies.

2.1. COMPUESTOS DE NITRÓGENO.

Los compuestos inorgánicos de Nitrógeno disponibles para el crecimiento vegetal están presentes en varias formas diferentes: nitratos, nitritos y amonio. En muy pequeña extensión, otros compuestos de nitrógeno tales como urea, ácido úrico y aminoácidos son también detectables, siendo ampliamente producidos por la excrección de los animales. Algunos de estos compuestos orgánicos de nitrógeno pueden ser directamente utilizados por el fitoplancton pero son también completa y rápidamente convertidos en amonio, por lo que la discusión se suele centrar siempre sobre las formas inorgánicas. De éstas, la reserva principal está constituida por los nitratos, siendo sus proporciones una expresión de la marcha de los procesos biológicos.

2.1.1. NITRITOS.

Los nitritos presentes en las aguas naturales se determinan por espectrofotometría después de la formación de un diazocompuesto coloreado producido por la reacción en medio ácido de los nitritos presentes en la muestra con sulfanilamida y posterior acomplejamiento del ión de diazonio formado con N-naftil etilendiamina. El método de la diazotización es útil para la determinación de nitritos en el rango de 1 – 25 µgr/l.

2.1.1.1. Fijación y conservación de la muestra.

Al tomar la muestra en el campo se utiliza cloroformo como agente bacteriostático (1 ml/l). En el laboratorio se procede a la eliminación de los sólidos presentes en la muestra a través de membranas de 0.45 micras de poro. Las muestras conservadas al abrigo de la luz y a temperatura ambiente son estables durante 5 - 10 h., debiendo de ser congeladas en caso de conservación más prolongada aunque en ningún caso es recomendable un almacenamiento demasiado largo.

2.1.1.2. Reactivos.

-Solución de sulfanilamida: Mezclar 50 ml. de ClH concentrado con 300 ml. de agua destilada. En ella se disuelven 5 gr. de sulfanilamida y se diluye a 500 ml. con agua destilada. La solución es estable muchos meses.

- Solución de N-(l-naftil) etilendiamina: Disolver 0.5 gr. en 500 ml. de agua destilada. Guardar en botella oscura y en frío y renovar cada mes e incluso antes si aparece coloración marrón.

- Solución standar de nitritos: Se pesan 0.345 gr. de NO2Na seco (105 ºC durante 1 h.) y se disuelven en 1000 ml. de agua destilada. Se guarda en botella oscura con 1 ml. de cloroformo. Es estable durante unos 2 meses y 1 ml. contiene 5 ugrat N-NO2/l.

2.1.1.3. Operaciones analíticas.

- Muestra problema.

A 50 ml. de muestra se añade 1 ml. de sulfanilamida. Se agita y se deja reaccionar durante 2 minutos. A continuación se añaden 1 ml. de N-(naftil) etilendiamina y se agita. La coloración está totalmente desarrollada después de 10 minutos, midiéndose la extinción a 543 nm. .

- Análisis del blanco.

Con 50 ml. de agua destilada se procede como con la muestra problema, no debiendo exceder su extinción de 0.03.

- Análisis de la solución patrón.

Se toman 10 ml. de la solución standar de nitritos y se llevan a 1000 con agua destilada ( 1 ml. de esta solución contiene 5.10-2 ugr.at/l.) debiéndose utilizar en el mismo día. A continuación se toman varios volúmenes de 2 ml. de esta solución y se llevan a 50 ml. con agua destilada, llevándose a cabo la determinación como para las muestras problema, correspondiendo su extinción a una concentración de 2 µgr.at/l. (se puede confeccionar una curva patrón a partir de distintas diluciones de la solución. standar diluida)

2.1.1.3. Cálculos.

Concentración de la muestra: (µgrat N-NO2/l.) = Extinción. K

Am = media de la absorbancia de los patrones. 

Ab = Absorbancia del blanco. 

2.1.2. NITRATOS

2.1.2.1. Fundamento.

Los nitratos son rápida y casi cuantitativamente (= 100%) reducidos a nitritos cuando la muestra se hace pasar a través de una columna conteniendo limaduras de cadmio-cobre con un tampón NH4Cl/NH4OH, aunque son imprescindibles muchas precauciones para mantener La columna en buen estado.

2.1.2.2. Aparatos: Columna reductora.

 

La columna se construye con 3 piezas de vidrio de las medidas señaladas en el gráfico. Se coloca un tapón de fibra de vidrio al final de la columna y se llena de agua destilada. A continuación se rellena el cuerpo intermedio con limaduras de Cd cuidando que no queden burbujas de aire (las limaduras nuevas se lavan repetidas veces con sulfato de cobre al 2% de forma que al eliminar el sobrenadante éste arrastre las partículas más pequeñas). Una vez llena de limaduras se coloca un nuevo tapón de fibra de vidrio en la parte superior y se hace pasar la solución de cloruro amónico diluida en flujo continuo. Este flujo no debe ser mayor de 8 ml. /mn. regulándose con las pinzas de Hoffman en caso contrario. Flujos menores incrementan innecesariamente el tiempo de análisis y no aportan mayor eficacia. Cuando la columna no se utilice ha de estar completamente llena de cloruro amónico diluido, debiéndose inspeccionar constantemente su estado y regenerarla siempre que se introduzca aire en su interior, en cuyo caso se extraen las limaduras, se lavan varias veces con ClH al 5% y se sigue el mismo proceso que para su preparación.

 2.1.2.3. Reactivos.

 - Solución de cloruro amónico concentrado. Se disuelven 100 gr. de cloruro amónico en un matraz aforado de 500 ml. y se enrasa con agua destilada. Se guarda en botella de plástico.

- Solución de cloruro amónico diluida. Se diluyen 50 ml. de la solución anterior a 2000 ml. co nagua destilada, almacenándose del mismo modo.

- Solución standar de nitratos. Disolver 1.02 gr. de NO3K en 1000 ml. de agua destilada. Esta solución es estable durante mucho tiempo y su concentración es de 10 ugratN-NO2/ml.

2.1. 2.4. Operaciones analíticas.

- Muestra problema.

Se toman 100 ml. del agua a analizar y se les añaden 2 ml. de cloruro amónico concentrado con la finalidad de fijar el pH de la muestra y se hace pasar a través de la columna. Los 30-40 ml. inicialmente recogidos se utilizan para enjuagar el matraz que se vaya a utilizar y se eliminan. Los 50 ml. siguientes se recogen en una probeta y se transfieren al matraz, analizándose como se ha visto en los nitritos. No es necesario lavar la columna entre cada 2 muestras.

-Análisis del patrón.

Se toman 2 ml. de la solución standar de nitratos y se aforan a 1000 ml. con agua destilada, tomándose varios volúmenes de 100 ml. y procediéndose a su análisis como si de una muestra problema se tratase. Se hace la media de las absorbancias, que corresponde a una concentración de 20  µgrat N-NO¯3/1.

2.1.2.5. Cálculos.

 

Al haberse cuantificado aquí los nitritos debidos a la reducción de los nitratos y los nitritos presentes como tales en la muestra, restando estos últimos previamente de C, obtendremos los µgrat N-NO¯3 de la muestra.

2.2. FOSFATOS

El fósforo ha venido siendo considerado como el factor limitante principal del cual dependen la mayor parte de las veces las poblaciones de organismos acuáticos, guardando, en general, una relación la productividad de un agua y su concentración en fósforo o su enriquecimiento periódico en él. De aquí, que la determinación de los niveles de fósforo en las aguas naturales tenga cada vez más importancia.

En nuestro caso vamos a considerar solo los fosfatos que responden a los test colorimétricos sin necesidad de hidrólisis preliminares o digestiones oxidativas de las muestras y estos son considerados como "ortofosfatos" ya que el fósforo mineral disuelto en el agua de mar está esencialmente presente bajo la forma de ortofosfatos.

2.2.1. Fundamento.

El molibdato amónico y el tartrato de antimonio y potasio reacciona en un medio ácido con soluciones diluidas de ortofosfato para formar ácido fosfomolibdico que es reducido por ácido ascórbico desarrollándose una coloración azul que es medida en el espectrofotómetro. Esta técnica da resultados reproducibles y tiene la ventaja de necesitar un solo reactivo de reducción.

2.2.2. Reactivos.

- Solución de Molibdato amónico: Disolver 15 gr. de molibdato amónico tetrahidratado en 500 ml. de agua destilada. Conservar en la oscuridad, en botella de plástico y a 4 ºC.

- Solución de Ácido Sulfúrico: Diluir 140 ml. de ácido sulfúrico concentrado a 1000 ml. con agua destilada.

- Acido Ascórbico: Disolver 2.7 gr. de ácido ascórbico en 70 ml. de agua destilada. Esta solución es inestable.

- Tartrato de Antimonio y Potasio: Disolver 0.34 gr. de tartrato en 250 ml. de agua destilada. Esta solución es estable varios meses.

- Solución standar de Fosfatos: Disolver 0.817 mgr. de PO4H2K en agua destilada y diluir a 1000 ml.

- Reactivo mixto: Mezclar y agitar bien las siguientes cantidades de reactivos. (El reactivo mixto es estable durante solo 4 h.,siendo preciso lavar el vidio con sulfúrico antes de su utilización): 



100 ml. de molibdato


ó


50


ó


30


ó


20


250 ml. de sulfúrico


 


125


 


75


 


50


100 ml. de ascórbico


 


50


 


30


 


20


50 ml. de tartrato


 


25


 


15


 


10


______


 


______


 


______


 


______


500 ml.


 


250 ml.


 


150 ml.


 


100 ml.


2.2.3. Operaciones analíticas.

- Muestra problema:

A 50 ml. de muestra se añaden 10 ml. de reactivo mixto a temperatura ambiente entre 15-30 ºC. Se espera de 5-10 minutos y se mide la absorbancia a 885 nm. (límite de capacidad entre 0 y 5 µgrat/l.)

- Análisis del blanco:

Con 50 ml. de agua destilada se procede como con la muestra problema con la finalidad de detectar otros fosfatos ajenos a los contenidos en la muestra.

- Análisis del patrón:

Se diluyen 10 ml. de la solución standar de fosfatos a 1000 ml. con agua destilada. De esta última dilución se toma 1 ml. y se lleva a 100. La concentración resultante es de 0.6 ugat/1.

3 . MATERIA ORGÁNICA (DQO)

La determinación de la demanda química de oxígeno es una medida de la equivalencia en oxígeno de la porción de materia orgánica presente en una muestra que es susceptible de ser oxidada por un oxidante químico fuerte. En otras palabras ,comprende todo lo que pueda tener una demanda de oxígeno, especialmente las sales minerales oxidables (sulfuros, sales de metales, etc.) y la mayor parte de los compuestos orgánicos biodegradables ó no.

Actualmente existen aparatos muy sofisticados y costosos para la determinación de C, H, N... . No obstante, entre los métodos más sencillos que llevan a cabo una oxidación química por vía húmeda de los materiales orgánicos disueltos, y en función de la importancia que adquiere la polución en las zonas litorales estuáricas, etc., es factible utilizar el método menos sensible pero más fácil de llevar a cabo descrito por MICHEL (1972).

3.1. Fundamento.

Muchos tipos de materia orgánica son oxidados en medio ácido por un exceso de dicromato. Una muestra es tratada con cantidades conocidas de dicromato potásico y ácido sulfúrico y el exceso de dicromato es titulado con sulfato ferroso amoniacal (Sal de Mohr). La cantidad de materia orgánica oxidable, medida como mgr. de oxígeno, es proporcional a la de dicromato potásico consumido. En definitiva, la DQO corresponde a la fracción que ha sido consumida.

3.2. Reactivos.

- Ácido Sulfúrico.

- Sulfato mercúrico.

- Sulfato de PI ata.

- 1,10- phenantrolina monohidrato 0.0025 N

- Dicromato potásico

- Sulfato Ferroso Amoniacal.

- Solución Oxidante 0.025 N: En 750 ml. de agua destilada, añadir 125 ml. de sulfúrico concentrado y disolver en ebullición 100 gr. de sulfato mercúrico y 1 gr. de sulfato de plata. Después de enfriar, transferir la solución a un matraz aforado y disolver 1.226 gr. de dicromato potásico y llevar a 1000 ml.

- Solución de Sal de Möhr: Disolver 9.8 gr. de sulfato ferroso amoniacal en unos 300 ml. de agua destilada. Añadir 20 ml. de ácido sulfúrico y completar a 1000 ml.. Es necesario verificar la normalidad de esta solución en cada sesión de análisis debido a que el ferroso pasa fácilmente a férrico en contacto con el aire.

3.3. Muestreo y almacenamiento.

La determinación ha de realizarse sin dilación. Si hubiera que retrasar el análisis durante un tiempo, preservar la muestra por acidificación con sulfúrico.

3.4. Operaciones analíticas.

- Muestra problema.

Dejar decantar la muestra durante 2 h. . Transferir a continuación 10 ml. a un matraz erlenmeyer y agitando constantemente añadir 10 ml. de solución oxidante (se formará un precipitado de cloruro de plata que se disuelve fácilmente con la adición de sulfúrico. Si no es así, los cloruros están insuficientemente acomplejados por el sulfato de plata. A su vez, El sulfato mercúrico en exceso puede precipitar, ya sea por la adición de sulfúrico ó después del enfriamiento. Esta precipitación es tanto más importante cuanto la salinidad es más débil, aunque no influye para nada en el análisis) y 25 ml. de ácido sulfúrico. Se deja reposar durante 20 minutos y se añaden entonces 100 ml. de agua destilada. El exceso de dicromato se titula, en presencia de fenantrolina, con sal de Möhr.

- Análisis del blanco.

Se reemplaza la muestra problema por 10 ml. de agua destilada, procediéndose a continuación de la misma manera.

3.5.Cálculos.

Si han sido necesarios n m1. de sal de Möhr para titular el exceso de dicromato en la muestra y N ml. en el caso del ensayo en blanco, el resultado será:

DQO = 20 (N - n) mgr./l de O2

4. ALCALINIDAD.

La alcalinidad de un agua es la capacidad de neutralizar un ácido fuerte a un determinado pH. A la hora de determinarla, lo que más frecuentemente se mide es la cantidad de ácido fuerte que es preciso añadir a la muestra considerada para llevar su pH a un valor igual ó ligeramente inferior a 7, eliminando el CO2 por ebullición. Esta cantidad de ácido es la necesaria para transformar en una forma no ionizada los carbonatos y bicarbonatos, así como las otras sales de ácidos débiles (boratos, fosfatos, silicatos, arseniatos, ...) y además compensar el exceso de iones hidroxilo sobre los protones. La cantidad así medida recibe el nombre de Alcalinidad total.

Ordinariamente, en las aguas de mar, al ser la alcalinidad una función de los carbonatos, bicarbonatos e hidróxidos que contiene, la alcalinidad se da como un indicativo de la concentración de estos constituyentes. Es por ello que las variaciones de la reserva alcalina serían debidas esencialmente a las variaciones en las concentraciones de carbonato cálcico. La reserva alcalina estaría igualmente ligada, lo mismo que el pH, a la utilización del oxígeno y a la producción correlativa de CO2, implicando este último un aumento de la solubilidad del CO3Ca,y en consecuencia, de la alcalinidad.

4.1. Fundamento.

Los iones hidroxilo presentes en una muestra como resultado de la disolución por hidrólisis de solutos, son neutralizados titulándolos con un ácido.

4.2. Reactivos.

Solución de ácido fuerte: ClH  0.05N

Solución de base fuerte: NaOH  0.05N

Indicador mixto: 0.02 gr. de Rojo de metilo y 0.10 gr. de Verde de bromocresol se disuelven en 100 ml. de etanol.

Solución standar de carbonato sódico 0.1 N: Se disuelven 0.53 gr. de CO3Na2 en agua destilada y se llevan a 100 ml.

4.3. Muestreo y almacenamiento.

Las muestras se recogen en botes de polietileno o vidrio borosilicatado. Se llenan y cierran herméticamente, almacenándose a bajas temperaturas. En el caso de aguas contaminadas, al tener lugar procesos microbiológicos con pérdidas o ganancias de CO2 u otros gases, es preciso analizar la muestra antes de 24 horas. En cualquier caso, hay que evitar la agitación de la muestra y la exposición prolongada al aire.

4.4. Operaciones analíticas.

-Muestra problema.

A 200 ml. de muestra se le añaden 20 ml. de la solución de ácido fuerte y se deja hervir durante 10 minutos para eliminar el CO2 disuelto. Tras incorporar unas gotas de indicador mixto, se valora el exceso de ácido con la solución de base fuerte.

- Determinación del factor del ácido.

Se titulan 5 ml. de la solución standar de carbonato sódico tras añadirle unas gotas de indicador mixto.

 

-Determinación del factor de la base.

Se titulan 5 ml. de hidróxido sódico con el clorhídrico cuya normalidad ya tenemos corregida.

 

4.5. Cálculos.

 

Alcalinidad (meq./l.) = (0.05 x (20 F ClH - V NaOH) x 1000) / 200

5. DETERMINACIÓN DE PIGMENTOS ASIMILADORES.

El fitoplancton es la puerta de entrada de la energía solar en el ecosistema pelágico y la base de s u mantenimiento, estudiándose cada vez más con referencia a la concentración de pigmentos asimiladores en las células, lo cual puede utilizarse para estimar la biomasa y la capacidad fotosintetizadora del fitoplancton. Además, las razones entre los pigmentos pueden utilizarse como índice de las características taxonómicas y fisiológicas de las poblaciones fitoplanctónicas siendo posible deducir hasta cierto punto la naturaleza de las algas presentes en el medio estudiado.

El problema de la determinación cualitativa y cuantitativa de los pigmentos se ve agravado en las poblaciones planctónicas debido a la enorme dispersión de las mismas y a las interferencias causadas por la materia orgánica disuelta.

5.1. Recogida de Muestras.

La estandarización del volumen de agua a muestrear implica muchas dificultades derivadas de las diferencias en abundancia y composición de las comunidades fitoplanctónicas, oscilando ampliamente y estando en definitiva en función de las características locales y del momento, aunque normalmente suele variar entre 0.5 y 5 l. Ha de filtrarse antes de las 12 horas posteriores a su recogida, manteniéndose mientras tanto protegidas de la luz.

5.2. Operaciones de Filtrado.

El fitoplancton puede ser concentrado por filtración 'de la muestra de agua a través de una membrana de celulosa, o derivados de la misma, de 0.45 a 0.65 micras de tamaño de poro. También se pueden utilizar membranas de fibra de vidrio, pero existen evidencias de un menor poder de retención de material particulado aunque, en cambio, proporciona una filtración más rápida.

Antes de la filtración, los filtros pueden ser recubiertos por una cantidad de CO3Mg que proporcione 10 mgr/cm2 . Esta adición favorece una filtración más efectiva a la vez que previene la acidificación del extracto y por tanto retrasa la formación de feofitinas.

5.3. Desecación.

Una vez filtrada la muestra, se retira el filtro y se elimina la mayor parte posible de agua colocándolo unos instantes sobre papel absorbente.

5.4. Solventes.

Aunque el metanol es muy eficiente en la extracción y resulta recomendable para el fitoplancton de aguas dulces, la acetona al 90% resulta favorecida ya que la clorofila a es más estable en ella.

5.5. Extracción.

El filtro escurrido se introduce en un tubo de vidrio que contiene un volumen de solvente generalmente comprendido entre 5-10 ml.

5.5.1. Duración de la extracción. - El tubo conteniendo el solvente y el filtro se guarda en la oscuridad y en frío durante 24 horas, acelerándose la extracción mediante la trituración del filtro y pudiéndose también completar con una extracción en caliente.

5.5.2. Eliminación de residuos.- Los restos de filtro y otras sustancias en suspensión se eliminan sometiendo el extracto a una centrifugación a 4000 - 5000 r.p.m. durante 10 minutos.

5.6. Lectura.

5.6.1. Los extractos se medirán en un espectrofotómetro de lectura continua o en su defecto en un colorímetro de lectura puntual ,en cuyo caso, Las longitudes de onda seleccionadas a las que se medirá la densidad óptica serán las de 430 - 480 - 630 - 645 - 663 y 750 nm.

Al carecer las clorofilas de absorbancia a 750 nm., la lectura a esta longitud se deberá a la presencia de materiales absorbentes distintos de las clorofilas que podrían falsear los resultados.

5.6.2. La densidad óptica a una determinada longitud de onda ha de corregirse mediante la sustracción de la absorbancia a 750 nm. multiplicada por un factor dependiente de esa longitud.

 

Absorbancia corregida.= F . (A750 – 0.002) ,,

5.7. Cálculos.

Entre las diversas fórmulas de estimación de las clorofilas a partir de las absorbancias seguiremos las propugnadas por la SCOR:

donde la concentración de cloro a, b y c viene expresada en µgr/ml. de extracto, siendo A663, A640, y A630 las extinciones, densidades ópticas o absorbancias corregidas a esas longitudes de onda.

Multiplicando estas concentraciones de clorofila por el número de ml. de extracto y dividiéndolos por el número de litros de muestra filtrados, las obtendremos en µgr./l. ó mgr./m3.

 

BIBLIOGRAFÍA

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